Културальн.метод-выдел-е и накопл-е чистой культуры бак-ий с ее послед. Идентиф-ей.Некот.бак-ии обл-ют а\б резистент-ю,поэтому бак.анализ может включать опр-е чув-ти выдел. Чист-к-ры к а\б

Особ-ть: многоэтап-ть. Минус- длит-ть.

Иссл.ж-ти: крови, мочи, спинномозговой жидкости, слизи из зева и носа, кала

Для выдел-я исп-ся плотн.пит среды.Этапы: выдел-е чист.культуры

Методы предв.класиф-ии:

1)морф.анализ бак.колоний и их хар-ка на спец\дифференциальн.средах

2)микроскоп-я окраш бак-ий

Для окончат.индетиф-ии бак-ий: изуч-е б\х акт-ти (биотипирование);

обнаруж-е бак.Аг(серотип-е)-1)р-ция агглютинация на стекле-пр. для энтеробак-ий

2)иммуннодифф-я в агаре (коринебак-ии дифтерии)

опр-е чув-ти к бактериофагам (фаготипир-е)

ИММУНОЛОГИЯ

Антигенраспознающие рецепторы лимфоцитов.

Сравнительная характеристика BCR и TCR

B клеточный рецептор (BCR)			T клеточный рецептор (TCR)
1. Строение
Мембранный IgM (mIgM) реже IgDмономер с дополнительным гидрофобным доменом для заякоривания на плазматической мембране (специфичность 2 паратопов совпадает со спецификой секретируемых антител)	Гетеродимер, состоит из 2 гликопептидных цепей – α и β (скреплены дисульфидной связью). Каждая состоит из 2 функционально различных участков – вариабельного иконстантного Вариабельные участки (домены) обоих цепей образуют антигенсвязывающий центр TCR (паратоп CDR 1-3). Константные фрагменты α,β цепей обеспечивают фиксацию TCR на плазматической мембране и контакты с костимулирующими молекулами
2. Механизм усиления антигенного сигнала функционально зависит от
CD79a and CD79b		Цепи TCR экспрессируются на клеточной мембране только в сочетании с CD3
Даже после распознавания и связывания свободного антигена или MHC-белкового комплекса недостаточно сигнала для активации лимфоцитов. Необходимо взаимодействие с дополнительными молекулами. Их цитоплазматические фрагменты связаны с внутриклеточными энзимами (тирозинкиназами), активация которых запускает каскад, ведущий к экспрессии генов. Это индуцирует пролиферацию и дифференцировку наивных клеток в клетки эффекторы и клетки памяти
Рецепторный комплекс наивных лимфоцитов
BCR-комплекс= mIgM+CD79a+CD79b		ТCR-комплекс= TCR+CD3+CD4/8
3.Наличие секреторной формы
Да (свободный иммуноглобулин-пентамер)		Нет (не секретируется внеклеточно)
4. Механизм распознавания антигенов (главная особенность)!!!
Распознают эпитопнапрямую «без посредников»		Свободные эпитопыне воспринимаются Принцип двойного распознавания Только в комплексе с молекулой MHC на поверхности собственной АПК Рестриктированы по HLA (см. ниже)
5. Изменение в ходе иммуногенеза
1. Смена изотипа рецепторов на IgG, IgA и IgE , в результате переключения класса секретируемых антител (т.е после короткого IgM-всплеска начинают доминировать IgG-антитела). При повторном контакте с антигеном IgG-антитела преобладают с самого начала, так как рецепторы в клетках памяти с самого начала представлены, в основном, IgG-молекулами. 2. Повышается аффинность		1. Нет изменений, стабильный изотип 2. Аффинность постоянная
6. Сходство: клонированы по чувствительности к Аг (распознаванию антигеннных эпитопов) Каждый лимфоцит располагает рецепторами одной специфичности (одного идиотипа, т.е. клонирован по V -доменам) т.е. отличаются у лимфоцитов, реагирующих на разные антигены

2. Понятие "клонированность" в иммунологии означает:

1. Способность каждого В/Т-лимфоцита реагировать на единственный антиген (эпитоп). 2. Способность каждого В/Т -лимфоцита реагировать на несколько эпитопов. 3. Избирательное связывание антигенных пептидов HLA-молекулами антигенпредставляющих клеток. 4. Специфичность (эпитопная комплементарность) антигенраспознающих рецепторов лимфоцитов. 5. Клоноспецифичность CD-фенотипа Т и В лимфоцитов.

Лимфоциты неоднородны по способности распознавать антигены и реагировать с ними. Более того, каждый лимфоцит и его потомство (клон) настроены на взаимодействие с единственным антигеном (точнее эпитопом). Иными словами, лимфоциты клонированы по чувствительности к антигенам, и именно это определяет избирательность (антигенную специфичность) иммунного ответа. Молекулярной основой клонированности являются особенности рецепторов, связывающих антигены: рецепторы каждого клона уникальны, реагируя только с одним антигеном. Это означает, что число клонов и клоноспецифических рецепторов должно быть огромным, соответствуя необозримому числу потенциальных антигенов. До встречи с антигеном каждый клон представлен небольшим числом зрелых покоящихся клеток (их называют «наивными»). Связываясь с комплементарными рецепторами, антиген обеспечивает активацию лимфоцита, действуя как селекционирующий фактор (селекция клона). Численность клона возрастает (экспансия клона), а входящие в его состав лимфоциты дифференцируются в клетки-эффекторы и клетки-памяти.

БАКТЕРИОЛОГИЯ

3. Признаки микобактерий туберкулеза, связанные с особенностями их клеточной стенки:

1. Кислотоустойчивость. 2. Медленная скорость размножения. 3. Резистентность к фагоцитам. 4. Устойчивость во внешней среде. 5. Высокая чувствительность к антибиотикам.

ТУБЕРКУЛЕЗ . род Micobacterium Родовой признак - кислото, спирто- и щелочеустойчивость. семейство Micobacteriaceae (сапрофиты) отдел Firmicutes. Неподвижные, аэробные гр+ палочковидные бактерии. Иногда образуют структуры, напоминающие мицелий, отсюда название. Для окраски применяют метод Циля-Нильсена. Болезнь вызывается 3 видами микобактерий: Mycobacterium tuberculosis - человеческий вид, Mycobacterium bovis - бычий вид, Mycobacterium africanum - промежуточный вид. [Возбудители микобактериальных антропонозов: M.leprae, m.tuberculosis. возбудитель микобактериального зооноза: M.bovis.] резервуар- больной, путь заражения- аэрогенный. Заболеваемость возрастает всвязи с низким уровнем гигиены, и т.д. Палочка Коха- тонкая, прямая или слегка изогнутая, склонны к ветвлению. Методом Циля-Нильсена окрашиваются в красный цвет,содерж кислотоуст гранулы(зерны Муха в цитопл).нужны факторы роста. В жидких средах синтезирует корд-фактор- фактор вирулентности. Синтезирует много никотиновой кислоты- ниацина(ниацин тест-метод дифферн микобакт). Липиды клеточной стенки: миколовые кислоты, корд-фактор, микозиды, сульфатиды. Поэтому она кислотоустойчива, "бронированное чудовище". Резистентность к фагоцитам, . устойчив во внешн среде. Факторы антифагоцитарной активности: липиды клеточной стенки, сидерофоры.

Патогенез: проникновение в альвеолы; размножение в альвеолярных макрофагах(корд-фактор ингиб фагосомно-лизасомн слияние); формирование неспецифической доиммунной гранулемы(вокруг инфициров клеток формир вал, из макрофаг); проникновение бакт в регионарные лимфатические узлы; индукция Т-клеточного иммунитета; Т-зависимая активация макрофагов(сначала Тхелп усилив биоцидность заражен макрофагов, потом Ткил уничт зараж макроф); формирование специфической постиммунной гранулемы. Заверш процесса-фиброз, кальцификация, формир латент инфекц, форм иммун к экзоген реинфициров-ю. [Инициация процесса- внутримакрофагальная инвазия. Механизмы: неагрессивный фагоцитоз, подавление образования фаголизисом, активное противостояние биотоксическим факторам фаголизосом, подавление функциональной кооперации между макрофагами и Т-лимфоцитами.] Первичн туберкулез-преимущ в детск возрасте проявление(+субфеб темп) - Первичный иммунный комплекс- очаг Гона. В гранулеме клетки Пирогова-Лнгханса, по периметру- лимфоциты, мононуклеары. Возможна реактивация эндогенн инф(вторич тубик) или экзоген реинфекция редко, развивается на фоне аллергии к туберкулопротеинам У лиц с ослабленным иммунитетом возможен диссеминированный туберкулез. Туберкулин- комплекс туберкулопротеинов (белковых дериватов), используется в аллергодиагностике. [Применяют адъювант Фройнда: пептидогликан+липиды клеточной стенки]. Туберкулопротеины обладают имунологически зависимой болезнетворностью, участвуют в реализации протективного иммунитета, используются в аллергодиагностике. Липиды клеточной стенки: антимакрофагальная активность, участвуют в индукции Т-клеточного иммунитета как адъюванты, определяют культуральные и тинкториальные особенности бактерий. Главная функция макрофагов в зоне неспецифической гранулемы: возбуждение реакций клоточного иммунитета. Постиммунная гранулема: возникает на фоне реакции гиперчувствительности замедленного типа к туберкулопротеинам, зона для функциональной кооперации между макрофагами и Т-эффекторами, основа для деструктивных реакций, основа для саногенеза(выздоровл), завершается бессимптомной персистенцией возбудителя. Деструкт процессы при туберкул определ-ся: имуннологически опосредованные эффекты микобакт АГ, цитокин-зависимая актифация макрофагов, аллергия к туберкулопротеинам. Иммунитет Противотуберкулезный иммунитет нестерильный инфекционный, [обусловлен наличием в организме L-форм микобактерий.]клеточный, антибактериалн

Лаб диагн. К обязательным методам обследования относится бактериоскопическое, бактериологическое исследование, биологическая проба, туберкулинодиагностика, основанная на определении повышенной чувствительности организма к туберкулину(очишен смесь белков возбуд туб-а). Чаще для выявления инфицирования и аллергических реакций ставят внутрикожную пробу Манту с очищенным туберкулином в стандартном разведеНИИ(до 14 лет). Флюрографию. Лечение-антибиотикотерап, хирур вмешат.

Специфическую профилактику проводят путем введения живой аттенуир вакцины - BCG(БЦЖ), внутрикожно на 5-й день после рождения ребенка. Проводят последующие ревакцинации7, 13лет.

ВИРУСОЛОГИЯ

4. Гемагглютинин ортомиксовирусов:

1. Инициирует взаимодействие вируса с клеткой. 2. Обретает активность после ограниченного протеолиза. 3. Фактор слияния. 4. Протективный антиген. 6. Имеется у всех типов (видов) рода Influenza.

Ортомиксовирусы Род Influenzavirus семейства orthomixoviridae(слизь, те сродство с муцином). Различают 3 типа-А,В,С.«-»РНК (8 сегментов,однонитевая это А и В, 7 у С) Подобная сегментарность позволяет двум вирусам при взаимодействии легко обмениваться генетической информацией и тем самым способствует высокой изменчивости вируса., спиральный нуклеокапсид(сост из рнк, нуклеопротеина(структур и регулят роль и типоспец аг) и протеина), суперкапсид-есть(=» сложные). Белки(ферменты) рнк-полимеразн комплекса: белок РВ1(транскриптаза), белок РВ2(эндонуклеаза), белок РА(репликаза). Далее идет М-белок(участв в сборке вирус частиц, типоспецеф АГ), далее билипидный слой(формир из мембраны клет хозяина, чувств к эфиру)из котор гликопротеинов шипы, сост из геммаглютинина(Н) и нейроминидазы(N(у типа С нет ее))

АГ-ая структура: внутренние - NP, белок-М, белки РНК полимераз комплекса. Наружные – Н(разновид 15, у чел:Н1-3) и N(9, у чел:N1,N2). Репликация ч/з иРНК.

(транскриптаза, эндонуклеаза, репликаза). Репл в ядре и синтез

Путем эндоцитоза чз Н в эндосому, там кислая среда меняет конформацию, обнажает пептиды(F-белки) вызывающие слияние вирусной и фаголизосомальной мембраны =>депротенизация

Дрейф, шифт. вирусемия. Ремантадин.

Признаки: -РНК(=>она не может без транскрипц выполнять функции иРНК, фрагментарна), оболочечн(к внутр относят М-белок,нуклеопрот,ферм полимер компл)., возбуд ОРЗ, нуклеокапсид спирал сим. Дел-е на виды: (А,В,С) АГ-особ-ти внутр белков(нуклеопротина). А, В, С различ по: эколог, масштаб АГ-изм-ти, спектр вирион ферм, степ Эпидем-ти(лидер по патаген – вирус типа А, тип В промежуточ, тип С-служит причин спорадическ заболев те единичн вспышки). Белки суперкапс: N, H. H: инициир взаимод вир с Кл(тк имеет сродство к сиалированным гликопептидам и гликолипидам благодаря этому вирионы закрепл на плазм мемб), актив-ся протеолизом(синтез в виде предшест кот способ реагир с рецепт клет, но не обеспеч слияния вирион оболо с клеточ мембр=> должен пройти огранич протеолиз, протеазы расщепл геммаглют на H1и H2и после допол конформации в кисл среде эндосом, Н2инициир пр слияния) , ф-р слияния(способ выходу нуклекапсида в цитоплазм:в кисл среде эндосом, обнажаются специал структ гемаглют(сайты слияния) кот возбужд объединен вирусн и клеточ мембран), протект-АГ(те к нему ат блокир вирус и подавл инфекцию), у всех видов Influenza., Нейраминидаза: протективн аг,фактор распространения(те расширяет зону инфекции путем отщепления сиаловой кислоты от гликолепидов и гликопептидов те по сути инактивирующий рецепторы для гемагглютинина), отлич эпитопн изменчив. АГ-шифт(это сдвиг, неожиданный, скочкообраз кот ведет к полной смене антиген профиля Н,N и появлен новых субтипов): только тип А, экологич детерминир-н(привязка вирусов к респират тракту), генетич детерменир(зависит от генетич рекомбин генов при одновр заражении клет нескол штаммами),смена субтипов пов белк вириона, возн пандемии(Н1N1(это испанка)H3N2(вирус Гонконг) . Дрейф(медленн частичное обнавление с помощ точечн мутаций Н,N-эпитопов при сохранен антиген родства с поверх АГ родительск штамма, определяет штаммовые особенности внутри субтипа, дает начало штаммом с повышен эпидем проходимостью) эпид. Трудно вакцину получ: АГ- изм-ть, дрейф.

Экзаменационный билет 58.

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Понятие о специфической профилактике инфекционных заболеваний. Иммунологические основы вакцинопрофилактики. Работы Э Дженнера и Л.Пастера. Типы вакцин (убитые, живые, субъединичные; моно- и ассоциированные). Рекомбинантные вакцины, принцип получения. Конъюгированные вакцины. Мукозальные вакцины.

Иммунитет бывает пассивный(1.естествен приобрет-после инфекции и 2.искуств приобрет-после вакцины) и активный(1.естеств приобрет-АТ мамы через молоко или плаценту и 2.искусст приобрет-серотерапия). Неспецифическая проф-ка направлена на избежание зарадения, а специфическая напрвлена против конкрерт возбуд-й. Сущность вакцинации-сформировать память об АГ,что обеспечит быстрый иммун ответ. Для вакцины нужны только протективные АГ(т.е. которые выз-т выработку АТ)

ИСТОРИЯ:в 1778г в Дженнер доказал,что прививка «коровьей оспы» защ-т от зар-я натуральной оспой. Это был продукт чистого эксперимента. Это дата рождения вакцинологии. Сам термин «вакцина» дал Пастер. Он в 1881 «осознанно» ослабил вирулентноть бакт,культивируя их в неблагопр усл. Он приготовил первые вакцины против куринной холеры и сибирской язвы. В 885 он получил вакцины против беш-ва(позже оказадась,что это была убитая вакцины)

Типы вакцин:

1. ЖИВЫЕ- вводят ослабленных(аттенуированных) бакт. Осл-т физич,химич способами. «+»-высок иммуногенность и длительность эфф-та(тк ослабл бакт способны разм-ся в орг-ме,персистировать «-»- повыш реактогенность,нестабильность,ничтожная. Но вероятность реверсии вирулентного фенотипа. Пример:BCG

2. УБИТЫЕ-сод-т инактивир бакт,прост,грибы или вирионы. Их недостатки и достоинства противоположны живым вакцинам. Нужно чаще проводить. Пример: п-в гриппа,брюш тифа

3.СУБЪЕДИНИЧНЫЕ–состоят из очищенных протективных АГ. Реактогенность минимальна. О изкая имуногенность,которую усил с пом адьювантов

1) Конъюгированные- исп-т для созд-я имм-та против Т-независ АГ. Т-независ АГ не ост-т памяти.

2)Анатоксины-обезвреженные токсины бактерий. Проблема связана с тем,что моноинтокцикация редко встречаеться. Экзотоксины обрабатывают формалином и те теряют токсич св-ва, но сох-т иммун-ть. Они не предох-т от бактерионосительства. Пример: столбячий анатоксин

3)Рекомбинантные-это рекомбинантные молекулы ДНК,сделан на основе бактер плазмид,в кото встроены гены протективных АГ. Такие ДНК синт-т АГ, индуцирующ гуморальн и клечный имм.

1)Голые-спольз свободн плазмиды или те,что сорбированы на искуст носителях. Они безопасны. Пример: пртив гепатита В

2)Векторные-для доставки применяют ослабл бакт

4.МУКОЗАЛЬНЫЕ-создаются специально для имм-та слизист оболочек против инфекций респират,кишеч и полового трактов. Помисо д-я на месте они влияют и на общий имм-т. Их обязательно сопр-т адьюванты. Но их ведрение в практику идет оч медленно

Бактериологический метод исследования патматериала на предмет выделения и идентификации микобактерий включает 3 способа: бактериоскопический, культуральный и биологический / Р.В.Ткзова, 1983; И.И.Румачик, 1987,1993; А.С. Донченко, 1989; Ю.Я. Кассича, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л.П.Ходун, 1997/. Срок бактериологического исследования не должен превышать 3-х месяцев.

Учитывая, что макроскопические туберкулезные изменения в органах и тканях крупного рогатого скота вызывает возбудитель туберкулеза бычьего вида, исследовать такой материал бактериологически не имеет смысла. Если такой материал доставлен в лабораторию для исследования, то производят комиссионный осмотр и составляют акт. Материал обезвреживают.

Бактериоскопическое (микроскопическое) исследование материала заключается в приготовлении из каждого органа (или кусочков органа с подозрительными на туберкулез изменениями) и лимфатического узла, доставленных для исследования, по 2 мазка-отпечатка, высушивании их на воздухе, фиксации над пламенем спиртовки, окрашивании по Циль-Нильсену и просмотре окрашенных мазков под микроскопом, причем не менее 50 полей зрения в каждом мазке. Необходимо приготовить, как минимум, 20 мазков-отпечатков из материала от одной туши. Кроме того, мазки для микроскопии готовят также и из высеваемой на питательные среды взвеси материала.

Окраска мазков по Цилю-Нильсену является избирательной на выявление микобактерий: на синем фоне окрашенных тканей или посторонней микрофлоры микобактерии просматриваются как красные, розовые или рубиново-красные палочки. Лучше всего просмотр мазков вести под микроскопом-бинокуляром при увеличении 1,5 (насадка) х 7 (окуляр) х 90 или 100 (объектив).

Способ используют как сигнальный, поскольку наличие или отсутствие микобактерий в мазках абсолютно не влияет на ход дальнейших исследований и даже положительное заключение бактериоскопии не имеет юридической значимости (кроме птиц). Материал необходимо исследовать далее.

Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считают установленным, если из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев - человечьего или птичьего видов), получен положительный результат биопробы, а также при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при микроскопическом исследовании (п. 7.3.2. наставления).

Необходимо обратить внимание также и на то, что на приготовление мазков-отпечатков, их фиксацию и просмотр уходит очень много времени, а обнаружить в них микобактерии удается очень редко, даже в мазках из высеваемой взвеси материала. Поэтому в целях экономии рабочего времени и средств при исследовании материала от животных, не имевших изменений при убое, целесообразно ограничиться приготовлением и просмотром мазков только из высеваемой на питательные среды взвеси материала. Это не приведет к ущербу в диагностике туберкулеза, ведь исследование материала продолжается далее.

Кроме обычной световой микроскопии можно использовать люминесцентную микроскопию. Мазки готовят аналогичным образом, фиксируют и окрашивают смесью флуорохромов. Окрашенные мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Способ более чувствителен, однако менее специфичен, и поэтому мало приемлем, особенно в условиях практических лабораторий.

Культуральное выделение микобактерий на питательных средах является одним из важных звеньев в лабораторной диагностике туберкулеза на современном этапе. Однако питательные среды, на которые был высеян материал (на 5-10 пробирок в соответствии с наставлением), в первые 2-3 недели имеют частичный или полный пророст, как правило, из-за нарушения стерильности при посеве материала. Посевы выбраковываются как раз в тот период, когда вероятнее всего проявление первоначального роста атипичных микобактерий (не говоря уже о проявлении первоначального роста возбудителя туберкулеза, который проявляет рост еще позже). В таких случаях культуральный способ выделения микобактерий на питательных средах механически выпадает. Это одна из основных причин получения отрицательных результатов при бактериалогическом исследовании материала. В результате, не получив роста колоний микобактерий на питательных средах после посева материала, а лабораторные животные остались живы в течение 3-х месяцев, следует стандартный ответ лабораторий: «Возбудитель туберкулеза не выделен» или «Экспертиза материала на туберкулез отрицательная». На основании результатов проведенных исследований причина реагирования крупного рогатого скота на туберкулин не установлена, и это ведет к дальнейшему необоснованному убою значительного количества реагировавших на туберкулин животных в хозяйствах, благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, что наносит большой экономический ущерб, нарушает оборот и воспроизводство стада.

Учитывая вышеизложенное, необходимо первоочередное внимание уделять культуральному способу выделения микобактерий из материала на питательных средах, как самому слабому звену в бактериалогической диагностике туберкулеза в районных ветеринарных лабораториях.

Положительные результаты культурального метода выделения микобактерий зависят, в основном, от двух обстоятельств: увеличение достоверности высева микобактерий из материала и соблюдение условий стерильности при работе в боксе.

Увеличение достоверности высева микобактерий из взятого для исследования материала зависит, в первую очередь, от качественного его отбора, предпосевной обработки и увеличения количества пробирок среды, на которого производят посев.

Основные условия, соблюдение которых при посеве материала на питательные среды гарантирует получение рост колоний микобактерий:

а) отбирать материал для бактериологического исследования от убитых животных, не имевших изменений при убое, отдельно от каждой туши и высевать на 10-20 пробирок среды каждую пробу (материал от каждого животного) по следующей схеме:

Лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные);

Бронхиальные и средостенные лимфатические узлы;

Мезентериальные (брыжеечные) лимфоузлы;

Прочие лимфоузлы (при наличии подозрительных участков);

Органы (тоже при необходимости).

В результате получается посев материала от одного животного на 30-50 пробирок среды. Этим достигается увеличение достоверности высева микобактерий в 3-5 раз, так как без разделения проб (по наставлению) высев материала рекомендуется проводить всего на 5-10 пробирок среды от двух голов одной фермы.

б) Непосредственно при бактериологическом посеве материала вырезать кусочки с нарушенной морфологической структурой лимфатического узла или органа (гиперплазия, уплотнение, точечные и полосчатые кровоизлияния и т.д.). Причем необходимо вырезать все измененные участки. Если материала по объему получается много в одну ступку, то его можно разделить в две.

в) Строго соблюдать взятую для работы методику, не нарушая режим обработки и высева материала.

г) При гомогенизации материала, особенно лимфатических узлов, необходимо использовать стерильный песок или мелкобитое стерильное стекло. Максимально растирать материал (до сметанообразной консистенции) для лучшего извлечения микобактерий из исследуемого материала

д) Добавлять физраствор к гомогенизированному материалу в ступку в количестве, необходимом для высева взвеси материала на питательные среды и для биопробы (в среднем до 0,5 см3 в одну пробирку и 1 -2 см3 для подкожного заражения одной морской свинки). Это количество физраствора можно рассчитать заранее.

е) Просмотр посевов материала проводить через 3, 5, 7, 10, 15 дней и в дальнейшем один раз в неделю.

ж) Любая выросшая на среде колония микроорганизмов (типичная или атипичная, пигментная или беспигментная, слизистая или суховатая и т.д.) должна пройти микроскопию при избирательной окраске по Циль-Нильсену.

Следует обратить внимание на степень отмывки материала от кислоты (или щелочи), применяемой для обработки материала от контаминации посторонней микрофлорой. Остаточное количество кислоты всегда будет присутствовать во взвеси из высеваемого материла, однако оно должно быть минимальным. Показателем этого служит восстановление первоначального цвета среды на 2-4-ый день после посева материала. Если цвет среды не восстановился, это свидетельствует о повышенном количестве остаточной кислоты. Цвет среды приобретает синеватый оттенок различной интенсивности. Рост (предполагаемых) микобактерий в данном случае замедляется, либо его не будет вообще, особенно возбудителя туберкулеза как более требовательного к режиму культивирования. Остаточное количество кислоты действует на микобактерии в некоторой степени бактериостатически.

Для герметизации пробирок после посева материала можно применять ватные и ватно-марлевые пробки с последующей заливкой их парафином, резиновые без- и резиновые с вырезанным косым желобком, корковые и металлические пробки (затворы).

При определении видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий известно много (около 300) различных тестов: культурально-морфологические, биологические, биохимические, серологические, определение лекарственной устойчивости и т.д. Однако в ветеринарной практике применяется их минимум (см. наставление). Для лабораторий достаточно определение выделенной культуры микобактерий следующих видов: бычий, человечий и птичий, что определяется биопробой, а атипичные микобактерии - разделить на группы по Runyon (1959): I - фотохромогенные (образующие пигмент под воздействием света), II - скотохромогенные (образующие пигмент независимо от воздействия света - и в темноте, и на свету), III - нехромогенные (не образующие пигмента) или еще их называют беспигментные (сюда же отнесен и возбудитель туберкулеза птичьего вида), IV - быстрорастущие микобактерии и кислоустойчивые сапрофиты.

Для этого достаточно эффективно и экономически оправдано изучение свойств выделенной культуры по сокращенной схеме, в которой основное внимание уделяется срокам появления первичного роста колоний, пигментообразованию, культурально-морфологическим и тинкториальным свойствам при окраске по Цилю-Нильсену. Особенно значим тест на корд-образование в первичной или даже в субкультуре в сочетании с результатами биопробы. Для приготовления мазков из выросших колоний целесообразно одновременно делать их как из колоний, так и из остатков взвеси и конденсата, т.е. с жидкой части на дне пробирки.

Кроме того, сотрудники лабораторий имеют возможность не только проводить контрольный убой реагировавших на туберкулин животных и отбирать пробы материала для исследования, но и отбирать для бактериологического исследования при жизни животных (бронхиальная или носовая слизь, молоко, фекалий, моча, экссудат, кровь и т.д.), а также пробы кормов, воды, объектов внешней среды на предмет выделения микобактерий и, таким образом, косвенно доказывать причину реагирования скота на туберкулин. При посеве дополнительного материала и проб из объектов внешней среды используют общеизвестные методы концентрирования микобактерий: седиментационный, флотационный, флотационно-седиментационный и другие.

Сокращенная схема дифференциации микобактерий с использованием биопробы

Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания. Роль диагностики состоит в том, что ранний, точный, исчерпывающий и максимально конкретный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исходов заболевания, служит начальным моментом в проведении своевременных и направленных противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

В современных условиях диагностика инфекционных болезней сохраняет все свои традиционные черты, сформировавшиеся за последние десятилетия. В то же время она характеризуется непрерывным совершенствованием уже найденных приемов и методов распознавания болезней и поисками новых, более эффективных, в том числе экспрессных.
Различают следующие методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций: бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный), биологический (экспериментальный), иммунологический (серологический), аллергический.
Основным методом является бактериологическое исследование. Он заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации. Определение вида возбудителя производят по ряду признаков: морфологии, тинкториальным свойствам (способность окрашиваться различными красителями), культуральным свойствам (характер роста на искусственных питательных средах), биохимическим свойствам (ферментация углеводов и белков). Окончательную принадлежность выделенной культуры к определенному виду микроорганизмов устанавливают после изучения антигенной структуры, используя различные иммунологические реакции (агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.). В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится от 18— 24 часов до нескольких суток.

Бактериологический метод имеет множество достоинств. Одним из первых является изучение с его помощью качественного состава микрофлоры исследуемого биологического материала. Для постановки диагноза важное значение имеет количество микроорганизмов в 1 г изучаемого вещества и 1 мл жидкости, так называемое общее микробное число, измеряемое в колиниеобразующих единицах (КОЕ/г или КОЕ/мл). Для этого проводят посев определенного количества исследуемого материла на плотные питательные среды, после инкубации в термостате подсчитывают количество выросших колоний (колония - это видимое изолированное скопление представителей одного вида микроорганизмов, образующееся при размножении одной колониеобразующей единицы на плотной питательной среде).
К наиболее впечатляющим результатам, достигнутым микробиологией, относятся создание и внедрение в практику антибиотиков. В связи с широким распространением лекарственно-устойчивых форм бактерий, для назначения рациональной химиотерапии необходимо определение антибиотикограммы - чувствительности к антибактериальным препаратам выделенной чистой культуры возбудителя. Для антибиотикограммы используют либо метод бумажных дисков, либо метод серийных разведений.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений антибиотик разводят в пробирках с жидкой питательной средой, затем засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. С помощью метода серийных разведений проводится определение минимальной подавляющей концентрации (МИК) антибиотика, которая служит для расчета терапевтической дозы препарата.

Бактериологический метод позволяют поисследовать механизмы антибиотикорезистентности выделенных культур (метициллинрезистентность, продукция b-лактамаз). Также можно оценить концентрацию антибиотика в очаге инфекционного процесса, изменение антибиотикочувствительности в динамике лечения.
Для врача-клинициста важно знать, насколько эффективно проводимое антимикробное лечение, поэтому возможно оценивать динамику изменения качественного и количественного состава в ходе заболевания и терапии. С помощью бактериологического метода диагностики можно определить, каков исход инфекционного процесса - выздоровление, носительство, хронизация.
Основными возбудителями инфекционных заболеваний в настоящее время выступает условно-патогенные микроорганизмы, роль которых в генезе заболевания сложно доказать. Поэтому немаловажно оценить патогенность выделенной условно-патогенной микрофлоры.
Организм человека заселен представителями так называемой нормальной микрофлоры, изменение качественно-количественного состава котрой может играть роль в развитии дисбиотических нарушений. Поэтому можно проводить исследование микрофлоры организма человека - в норме и при дисбиозах, межмикробные взаимоотношения при терапии эубиотиками.
Любые медицинские учреждения подвержены риску развития внутрибольничной инфекции. Диагностика ее, определение возбудителя, выявление источника инфекции, доказательства идентичности штаммов - составляющая часть работы бактериологической лаборатории (3).
Современный этап развития микробиологии характеризуется новыми открытиями, сделанным при изучении механизмов формирования патологических состояний. Основными считают установление факта существования бактерий в организме человека в составе различных сообществ, получивших общее название биопленки, и выявление опосредованного действия микробов на организм человека. Свойства бактерий в биопленках отличаются от таковых у изолированных клеток, что сказывается на всех аспектах взаимодействия микроба и окружающей среды, включая факторы иммунной защиты и антимикробные препараты (4,5).
Биопленка - хорошо организованное, взаимодействующее сообщество микроорганизмов (Quorum sensing - чувство кворума). 99% бактерий в природных экосистемах, 80% бактерий при инфекционных заболеваниях существуют в виде биофильма.

Биопленка связывает клетки, органические и неорганические субстраты, повышает адгезию бактерий к эпителию и любым поверхностям (живого и неживого происхождения), снижает эффективность антибактериальной терапии, помогает выживать бактериям в меняющейся внешней среде. Микроорганизмы в биопленке более устойчивы к действию как антибактериальных препаратов, так и факторов неспецифической противоинфекционной защиты организма человека.
Механизмы увеличения устойчивости бактерий к антибиотикам в биопленках связаны с ограничением проникновения антибиотиков через нее, уменьшением скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков, генетическими изменениями у персистирующих в биопленке бактерий.
С помощью бактериологического метода можно изучать механизмы защиты микроба от иммунной системы организма, стратегию выживания его в макроорганизме - персистенцию. Микробы имеют механизмы защиты от иммунной системы человека - антилизоцимную, антикомплементарную, антилактоферриновую активность.
Таким образом, в настоящее время бактериологический метод диагностики позволяет исследовать многие аспекты жизнедеятельности болезнетворных бактерий, механизмы их развития, выживания и подавления.

Литература

1. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции кожи, мягких тканей, костей и суставов. — СПб.: КЛЕ Т, 2006. — 128 с.
2. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии /Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. Смоленск: МАКМАХ, 2007. - 464 с.
3. Руднов В.А.Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации Инфекция и антимикробная терапия 2002. - Т. 4, №3
4. Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека // Инфекции в хирургии. 2004. - Т. 2,№ 3. - С. 16-20.
5. Anwar H., Strap J.L., Costerton J.W. Eradication of bio?lm cells of Staphylococcus aureus with tobramycin and cephalexin. // Can. J. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 618-625.

Суть бактериоскопического метода: обнаружение микробов в исследуемом материале; изучение их морфологических и тинкториальных свойств, характер расположения в бактериологическом мазке в поле зрения.

Техника выполнения. Материал от больного визуально изучается, выбирается порция, в которой с наибольшей долей вероятности может быть обнаружен возбудитель заболевания (комочки слизи, гнойные пробки). Он наносится на предметное стекло (иногда материал предварительно эмульгируется в физиологическом растворе, реже подвергается центрифугированию). Капля распределяется по стеклу, высушивается и фиксируется. После этого мазок окрашивается, и препарат просматривается под микроскопом. Обычно мазок окрашивается по Граму. Иногда, как наиболее щадящий, применяется один из простых методов окраски, тогда препарат красится одним красителем (например, при диагностике менингококковой инфекции, холеры).

При необходимости используются специальные сложные методы окраски, например метод Бурри-Гинса для выявления капсульных микроорганизмов или метод Циля-Нильсена для выявления наличия кислотно-устойчивых бактерий. В отдельных случаях (в частности, при изучении двигательной активности микроорганизмов) готовят препараты «висячая капля» и «раздавленная капля» и микроскопируют неокрашенные бактерии.

Достоинства бактериоскопического метода: простота исполнения, возможность быстрого получения результатов, техническая и экономическая доступность.

Недостатки метода: для определения вида микроорганизмов зачастую бывает недостаточным определение его морфологических свойств, так как они идентичны у представителей родственных видов. Кроме того, бактерии с характерной морфологией нередко подвергаются изменениям, особенно под действием антибиотиков, и становятся неузнаваемыми; наконец, концентрация возбудителей в исследуемом материале может быть чрезвычайно низкой, и тогда их трудно обнаружить.

С учетом вышеуказанного, бактериоскопический метод редко используется как единственный и окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он применяется как ориентировочный, предварительный, а при диагностике некоторых инфекционных заболеваний он вообще не предусматривается.

Как понимать ориентировочность и предварительность? Это касается врача-клинициста и врача-бактериолога. Клиницист, получая предварительный ответ (положительный или отрицательный), в большей или меньшей степени использует полученную информацию в своих дальнейших исследованиях до получения окончательного результата бактериологического метода диагностики. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о подозреваемом возбудителе, о его концентрации в используемом материале, о наличии сопутствующей микрофлоры, определяет способы обработки материала и выделения чистой культуры возбудителя, выбирает питательные среды для последующего культивирования.

Бактериологический метод

Суть метода - выделение чистой культуры микроба - возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью после­дующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.

А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов - возбудителей.

Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).

А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний - самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.

Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе). В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясопептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель - накопление чистой культуры микроба - предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.

У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда, среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясопептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже - методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.

Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда - его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.

Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют биологический, аллергологический или другие методы исследования.

Достоинства бактериологического метода диагностики: высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.

К недостаткам метода можно отнести длительность исследования (не менее 4-5 дней), а также невозможность его использования в тех случаях, когда возбудители (например, риккетсии, хламидии) инфекции не растут на искусственных питательных средах.

Биологический метод

В некоторых случаях для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний применяется биологический метод (биопроба), предусматривающий заражение лабораторных животных. При этом перед исследователем могут стоять различные цели:

Воспроизведение клинической и патологоанатомической картины заболевания (например, при диагностике столбняка, лептоспироза);

Выделение в короткие сроки чистой культуры возбудителя (при диагностике пневмококковой инфекции);

Определение вирулентности и патогенности возбудителя (при диагностике туберкулеза);

Определение вида и типа токсинов (при диагностике ботулизма)

Для диагностики инфекционных заболеваний используют различных животных. Выбор их определяется видовой восприимчивостью к различным этиологическим агентам. Например, мыши чувствительны к пневмококковой инфекции, сибиреязвенной, столбнячной; морские свинки - к возбудителям туберкулеза, бруцеллеза, туляремии; кролики - к стафилококкам, стрептококкам, ботулизму. Для исследования отбираются только здоровые животные определенного возраста и массы тела.

Перед введением материала животных фиксируют. Мелких животных держит экспериментатор, для крупных используют специальные приспособления. Место введения инфецированного материала обрабатывают спиртом или йодом. Инфицированный материал вводят в зависимости от особенностей патогенеза изучаемого заболевания подкожно, накожно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально и т.д.

При накожном методе заражения предварительно выстригают шерсть, скарифицируют кожу, после чего втирают в неё материал.

Подкожный метод: кожу животных захватывают в складку, лучше пинцетом, вводят иглу до половины, после инъекции накладывают ватку со спиртом и извлекают иглу.

Внутримышечный метод: материал вводят в мышечную ткань верхней части задней конечности.

Внутрибрюшинный метод: животное держат вниз головой, чтобы не поранить кишечник. Инъекцию делают в нижней части живота, сбоку от средней линии. Брюшную стенку прокалывают толчкообразным движением, шприц под прямым углом.

Внутривенный метод: мышам, крысам вводят материал - в хвостовую вену или внутрисердечно. Кролику вводят - в ушные вены, которые поверхностно расположены и хорошо видны (лучше пунктировать наружную вену). Место введения после инъекции зажимают ватой со спиртом, чтобы не было кровотечения. Морским свинкам при внутрисердечном заражении вкалывают иглу на высоте «толчка» сердца в межреберный промежуток. Если игла введена правильно, в шприце появится кровь.

Подготовка инструментов и материалов: шприцы, скальпели, иглы стерилизуются кипячением. В шприц набирают материал (немного больше, чем необходимо ввести), поворачивают вертикально вверх, покрывают иглу стерильной ваткой и выталкивают поршнем из шприца пузырьки воздуха. Эту манипуляцию проводят над дезраствором.

При диагностике инфекций, обусловленных действием токсина (ботулинического, сибиреязвенного) материал, предположительно содержащий возбудителя и токсины, помещают в физиологический раствор, затем фильтруют через бумажный фильтр, натертый тальком (он хорошо адсорбирует токсин). Чувствительных животных заражают смывами с фильтров. В некоторых случаях, когда патогенез заболевания обусловлен патогенными свойствами самого возбудителя, животных заражают микробной взвесью.

Зараженных белых мышей маркируют и помещают в специальные стеклянные банки; на них наклеивается бирка с указанием даты заражения и вида микроорганизма, с которым проводилась работа. Точно так же подписывают клетки с зараженными кроликами или морскими свинками. За животными наблюдают. В случае гибели их сразу же вскрывают.

Перед вскрытием белых мышей животных предварительно умерщвляют парами эфира. Мышей ненадолго погружают в дезраствор и затем фиксируют в кювете брюшком вверх за лапы. Отмечают наличие или отсутствие внешних патологических изменений. Разрез кожи делается продольно от лобка до нижней челюсти и поперечно - по направлению к конечностям. Отмечают изменения в кожной клетчатке и состояние лимфоузлов. Из последних делают мазки-отпечатки. Для осмотра грудной полости удаляют грудину, надрезав ножницами ребра с обеих сторон. После внешнего осмотра отрезают кусочки сердца и помещают в МПБ. Делают посев непосредственно на МПА мазки-отпечатки из сердца, легких.

Вскрывают брюшную полость, при внешнем осмотре отмечают состояние внутренних органов (величину, цвет, консистенцию, наличие гнойных очагов). Делают посевы печени, селезенки и мазки отпечатки.

Работа проводится стерильными инструментами, после каждого взятия органа пинцет и ножницы опускаются в стакан со спиртом и обжигают.

После вскрытия труп и кювету, где производилось вскрытие, заливают дезраствором на сутки.

Посевы инкубируют в течение 24 часов (при необходимости и более) при

t 37 о С. Затем их просматривают, выделяют чистую культуру возбудителя и осуществляют его идентификацию при помощи бактериологического метода.

Достоинства метода: достоверность полученных результатов, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре.

Недостатки: дороговизна, ограниченность применения, опасность инфицирования.

Похожая информация.

Практическое занятие №2.

Тема: Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Цель: Изучить методы выделения чистых культур бактерий и овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

Вопросы для самоподготовки:

1.Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3.Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4.Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

Основные понятия темы.

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы . Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

фамилия, имя, отчество, возраст пациента; предполагаемый диагноз заболевания; предшествующая антимикробная терапия; характер материала; дата и время взятия материала; цель исследования; название лечебного учреждения, номер отделения, палаты; подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

Выделение чистой культуры возбудисуток); Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение , свойств и структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

Самостоятельная работа студентов на занятии.

Работа 1

Цель: Освоить бактериологический метод диагностики.

Задача. В бактериологическую лабораторию поступил исследуемый материал (испражнения) от больного с предварительным диагнозом: «Пищевая токсикоинфекция?». При микроскопии материала обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки.

Выделите чистые культуры микроорганизмов, проведите их идентификацию. Определите этиологию пищевой токсикоинфекции.

Методика:

Все этапы бактериологического метода условно осуществляются в течение одного занятия: студент выполняет манипуляции очередного этапа, относит материал в термостат и сразу получает готовый результат для выполнения следующего этапа исследования.

1. Посев исследуемого материала на агар в чашке Петри методом механического разобщения с целью получения отдельных колоний (1-ый день).

Простерилизованной в пламени горелки и охлажденной петлей берут материал для посева и вносят в чашку, слегка приоткрыв крышку. На поверхности питательной среды материал распределяют петлей следующим образом: у края чашки частыми штрихами образуют овальную площадку, на которой остается значительная часть материала, затем проводят параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см от одного края чащики к другому. При посеве петлю следует держать параллельно агару, чтобы не царапать его (рис.2.2.а). После рассева петлю вынимают из чашки и немедленно обжигают в пламени, одновременно закрывая чашку Петри крышкой. Чашку маркируют и помещают вверх дном в термостат на сутки.

2.Изучение культуральных свойств выросших колоний (2-ой день).

Через сутки при правильном посеве на последних штрихах вырастают отдельные колонии (рис.2.2.б). Дифференцируют разные типы колоний по величине, цвету (Рис. 2.3.а), форме, прозрачности, характеру поверхности (гладкая, шероховатая) и края (ровный, зазубренный) (рис.2.3.б). Из материала части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток изучаемой колонии отсевают петлей в пробирку на скошенный питательный агар для получения чистой культуры. Посев ставят в термостат на сутки.

3. Идентификация выделенной чистой культуры (3-ий день).

Через сутки выросшую чистую культуру идентифицируют по основным видовым признакам. Изучают морфологию при микроскопии мазка из чистой культуры. Осуществляют посев чистой культуры на тест-системы (стафитест, энтеротест) для изучения активности. Для этого готовят 1-миллиардную взвесь бактерий в физиологическом растворе, затем дозаторными или пастеровскими пипетками вносят 0,1 мл взвеси в лунки тест-системы. Планшет относят в термостат на сутки.

4. Определение вида выделенных микроорганизмов (4-ый день).

Через 24 часа оценивают результаты биохимической активности по изменению цвета индикатора в лунке и сопоставляют их с таблицами тест-системы. По результатам изучения свойств выделенных чистых культур определяют виды микроорганизмов, что является одной из конечных целей бактериологического метода диагностики. Используют определитель Берджи.

Результат оформляют в виде протокола исследования.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ.